石蠟切片制備基本步驟

一、準(zhǔn)備工作

（一）洗滌實(shí)驗(yàn)所需器皿：（玻璃器皿的清洗）

1、  用洗衣粉將玻璃器皿表里擦洗干凈反復(fù)洗刷

2、  將器皿在自來水下沖洗干凈

3、  將器皿倒扣在鋪有吸水紙或紗布的桌子上控干

注：一般情況下，經(jīng)以上步驟后，用蒸餾水洗過1~3次即可烘干備用，如果做特殊染色還需浸泡在酸性清潔液內(nèi)12~24小時(shí)，再經(jīng)自來水*沖洗，再用蒸餾水過洗1~3次 烘干備用。

（三）載玻片與蓋玻片的處理

1.        將所需載玻片與蓋玻片清洗后，放入硫酸重鉻酸鉀溶液中浸泡24小時(shí)

2.        流水沖洗，再用蒸餾水沖洗3遍

3.        95%~100%酒精浸泡24小時(shí)，用綢布擦干備用

注：在將載玻片與蓋玻片放入清潔液中時(shí)，要一片片地投入，使其不致重疊。

二、常用液體的配制

（一）緩沖溶液：

1．磷酸鹽緩沖液

A液：0.1mol/L磷酸二氫鈉

B液：0.1mol/L磷酸氫二鈉

A液與B液按比例混合調(diào)整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）

2．枸椽酸緩沖溶液

A液：0.1mol/L枸椽酸

B液：0.1mol/L枸椽酸鈉

A液與B液按比例混合調(diào)整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）

（二）固定劑：

1．甲醛：10%甲醛

福爾馬林    100ml

蒸餾水      900ml

注：實(shí)際甲醛含量只有3.6~4.0%但習(xí)慣上都將其視為10%。

2．10％中性福爾馬林鈣固定液

甲醛液    10ml

蒸餾水    90ml

加碳酸鈣至過飽和(以容器底部碳酸鈣沉淀1~2cm厚為適度)充分振蕩混合后，放置24小時(shí)取上清液使用。

3．4%多聚甲醛：

8%多聚甲醛

多聚甲醛   8g

蒸餾水    100ml

加溫至60℃左右，不時(shí)攪拌，成為乳白色溶液。滴加1N NaOH，并不停攪動(dòng)至液體清明。

1N NaOH

lN等于1L溶液中某種物質(zhì)1mol除以該物質(zhì)的氫當(dāng)量價(jià)所得數(shù)值的量

氧化鈉(NaOH )；分子量＝40．005，當(dāng)量價(jià)＝1

1N Na0H的配制方法為：m＝40．005／1＝40．005g。取40．005gNaOH溶解于1L蒸餾水中

4%多聚甲醛

8%多聚甲醛         50ml

0.1M磷酸鹽緩沖液   50ml

PH7.2

先取50 ml 8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氫鈉和0.1M磷酸氫二鈉將PH值調(diào)至7.2

6．Carnoy液：

冰醋酸     10 m1

無水乙醇   60 m1

以上三者臨用前混合，預(yù)冷至4℃后使用。24小時(shí)后固定液失效。

（三）染色液

1．Harris蘇木精液

A液：

蘇木精          1g

*        10ml

B液：

銨礬或鉀礬      20g

蒸餾水          200ml

冰醋酸          8ml

2．Mayer蘇木精掖

蘇木精         1g

鉀礬或銨礬     50g

碘酸鈉         0.2g

蒸餾水         1000ml

水合氯醛       50g

枸櫞酸         1g

將蘇木精，鉀礬及碘酸鈉依次加入水內(nèi)，略加熱并攪拌，此時(shí)液體呈藍(lán)色，待全溶后過夜。再加入水合氯醛及枸櫞酸并加熱至煮沸5分鐘，冷后過濾備用。如不急用可不煮沸而在室溫待其成熟，染液可較長期貯存使用。核染色鮮明，染色時(shí)間5—10分鐘。用該染液染色后，不需分化，充分水洗藍(lán)化后即可，伊紅復(fù)染細(xì)胞質(zhì)，使用一段時(shí)間后就要換新溶液。

3．Hasnsen甲礬蘇木精的配制

A液：蘇木精      1g

      無水乙醇    10ml

B液：鉀礬        20g

      蒸餾水      200ml

C液：高錳酸鉀    1g

      蒸餾水      16ml

三液分別溶化后，將A液倒入B液，再加入C液3ml，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠹訜嶂练序v，1分鐘左右，將容器置于冷水中使其迅速冷卻，此液配后即可使用，染后無需堿化，細(xì)胞核即為藍(lán)色，效果較好，高錳酸鉀可以迅速氧化蘇木精（每1g蘇木精需0.177g高錳酸鉀氧化）。

4．伊紅

0.5~1%水溶液或酒精溶液。

1．水溶性伊紅

伊紅    5~10g

蒸餾水  1000ml

冰醋酸  10滴

先將水溶性伊紅加入蒸餾水中，用玻璃棒攪起泡沫后過濾，再加冰醋酸。

2．醇溶性伊紅

伊紅            5~10g

70%~90%酒精   1000ml

冰醋酸  10滴

（四）其它

2．各級濃度酒精的配制

75%；85%；95%；100%酒精。75%和85%酒精用95%酒精配制；（取75ml95%酒精，加水至95ml，即為75%酒精）

3．鹽酸灑精

多用于多種染色過程中的分色，如蘇木精染色后分色。配法是在100ml的70％酒精內(nèi)加0.5~1ml的濃鹽酸(Hcl)。用鹽酸酒精分色后要經(jīng)自來水充分沖洗組織切片，去除所含的酸再作其他處理。

4．碘酒

取碘5g，溶于95％酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成

5．生理鹽水

以氯化納0.85~0.90g溶于100m1蒸餾水配成的生理鹽水適用哺乳動(dòng)物

石蠟切片制備基本步驟 之二

三、取材，固定

（一）   實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抓取及固定

1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法

要點(diǎn)：（1）動(dòng)作要輕緩；（2）不要突然襲擊；（3）如發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的毛發(fā)豎起來時(shí)，停一會(huì)后再抓；（4）將四肢打開，固定在木板或方形蠟板上。

2．實(shí)驗(yàn)家兔的抓取及固定方法

要點(diǎn)：（1）隨時(shí)撫摩其頭部；（2）防止被其腳爪抓傷；（3）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇固定方法。

3．豚鼠的抓取及固定方法

要點(diǎn)：先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓緊兩耳間頭頸部的皮膚，用另一只手托起臀部送到動(dòng)物固定臺(tái)上。

（二）   實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的編號、標(biāo)記、分組和被毛去除方法

1．編號和標(biāo)記方法

（1）染色法

編號原則：先左后右，從前到后

左前腳為1，左側(cè)腹為2，左后腿為3，頭頂為4，腰背部為5，尾基為6，右前腳為7，右側(cè)腹為8，右后腿為9。超過10可用不同的染色的標(biāo)記液，一種染色為個(gè)位，另一種為十位數(shù)。

（2）掛牌法

（3）耳孔法

一般來說，小型動(dòng)物適宜用耳孔法和染色法，中型動(dòng)物適用于掛牌法。

2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的隨機(jī)分組方法

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，常常需要將選擇好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，按研究需要分成若干個(gè)組，分組時(shí)為了避免人為因素的影響，常應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行*隨機(jī)化的分組。

3．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被毛去除方法

剪毛法

拔毛法

剃毛法

脫毛法：系用化學(xué)脫毛劑將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被毛脫去，適用于無菌手術(shù)野的準(zhǔn)備以及觀察動(dòng)物皮膚血液循環(huán)和病理變化。方法：將需脫毛部位的被毛先用彎頭剪刀剪去，盡量剪短，勿剪破皮膚。然后用溫水將該部位潤濕，再用紗布包扎棉球的小棒蘸脫毛劑，在需脫毛部位涂一層，經(jīng)2~3min后，用溫水洗去該部位脫下的毛，自然晾干備用，切勿用紗布去擦，以免損傷皮膚。

脫毛劑配方：

（1）硫化鈉3g

     肥皂粉1g

     淀粉7 g

     加水適量調(diào)成糊狀

（2）硫化鈉8g

     溶于100ml水中

（3）硫化鈉8g

     淀粉7 g

     糖4 g

     甘油5 g

     硼砂1 g

     加水75ml

（三）   實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死

處死動(dòng)物的方法很多，無論是采用哪種方法，都要盡力避免使動(dòng)物長時(shí)間陷于痛苦和瀕于死亡狀態(tài)。熱愛生命，珍愛動(dòng)物。

1．空氣栓塞致死法

要點(diǎn)：（1）常用于大的動(dòng)物（如：兔、貓、狗和猴等）；（2）用50~100ml注射器一只；（3）此方法迅速、方便，但各臟器淤血明顯。

2．麻醉后處死法

注：采用此方法，取材后一定要確定動(dòng)物是否已死亡，再行斷頸。

（1）吸入麻醉法

要點(diǎn)：（1）適用于較小的動(dòng)物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；（2）時(shí)間大約1~2分鐘；（3）注意防火

（2）注射麻醉法

要點(diǎn)：（1）適用范圍較廣；（2）注射方式可采用靜脈、腹腔、皮下和肌內(nèi)注射，常用的是腹腔注射；（3）注射致死量一般視動(dòng)物大小而定。

3．腦、脊破壞法

要點(diǎn)：（1）常用于蛙類；（2）用金屬針經(jīng)枕骨大孔進(jìn)入，破壞大腦和脊髓。

4．?dāng)囝^處死法

要點(diǎn)：（1）常用于小動(dòng)物；（2）用剪刀剪斷頸椎；（3）如果沒有特殊要求，不要使頭和軀干分離。

5．?dāng)嘧捣?/span>

要點(diǎn)：（1）常用于大白鼠和小白鼠；（2）一手固定頭部，一手拽住實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尾部，輕輕一拉扯斷其頸椎，使其脫位，椎管內(nèi)急性損傷癱瘓或死亡后取材；（3）此方法處死動(dòng)物組織結(jié)構(gòu)保存較好。

（四）   實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖

解剖步驟

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被麻醉或處死后，將其；固定在動(dòng)物解剖臺(tái)上，用紗布蘸取生理鹽水濕潤被毛；

2．從下頜至恥骨聯(lián)合沿正中線切開皮膚；

3．打開腹腔：沿肋骨下緣腹正中，用鑷子提起腹壁切開腹壁肌肉，至恥骨聯(lián)合，從肋骨下端向脊柱方向，將兩側(cè)腹壁剪開，充分暴露腹腔內(nèi)臟器；

4．打開胸腔：用剪刀沿肋骨的肋軟骨和骨的連接處由下向上剪開，不要剪斷鎖骨，剪時(shí)應(yīng)盡量貼著胸內(nèi)壁，并注意不要剪斷胸骨兩側(cè)的大血管。然后將肋弓提起，暴露腹腔內(nèi)臟器。

（五）   取材

取材一定要迅速，應(yīng)在動(dòng)物處死后立即進(jìn)行解剖和切取組織材料，否則會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生死后變化，進(jìn)而失去原有的結(jié)構(gòu)，如果進(jìn)行酶組化染色，將會(huì)使大量的酶失活和丟失。

取材方法和注意事項(xiàng)

（1）取材用的刀剪必須鋒利，取材時(shí)應(yīng)用鑷子夾該組織的周圍的結(jié)締組織，凡是用鑷子夾過的或用手壓過的組織均不可用。

（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇不同的取材方法（整體取出臟器法、單個(gè)臟器取出法和切取組織塊法等）

（3）取材的先后順序原則。根據(jù)死后組織結(jié)構(gòu)改變的速度的快慢而定。先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多血的器官及神經(jīng)組織。

（4）取材組織塊的大小既要保證組織的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm×1.0cm×0.5cm為好，但有些特殊要求的可視情況而定。

（5）較小的組織或器官（淋巴結(jié)、松果體、腦垂體和神經(jīng)節(jié)等）應(yīng)整體固定，但要破壞其表面一側(cè)的被膜。

（6）管狀及囊狀組織（消化管的取材）都不應(yīng)斜切，先將一段腸管或食管剪下，從中剪開管腔，使之成片狀，然后將其鋪在紙板下，黏膜面朝上，用大頭針或細(xì)線將四邊固定，用生理鹽水漂洗黏膜表面，然后固定。

（7）較細(xì)的管狀臟器（輸尿管、輸精管、輸卵管、中動(dòng)脈和靜脈等）應(yīng)取下1~2cm長，平鋪于硬紙片上或吸水紙上分段固定。

（8）取材要盡量注意臟器的完整性。

（9）應(yīng)根據(jù)所要觀察的部位及實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇組織的切面。對于病理材料，除切取病變部位外，還要切取病變和正常組織交界部分的區(qū)域，以利于進(jìn)行正常組織與病理組織的對比觀察分析。

（10）取材時(shí)要注明取材時(shí)間、組織器官名稱、固定液名稱、組織塊的數(shù)量、所取組織位于器官的部位等，以備查。

（六）   固定

1．固定的目的

2．固定的對象和方法

（1）固定的主要對象是蛋白質(zhì)；

（2）固定液的量要足夠，其固定液的量一般不少于組織總體積的10倍以上（一般為1：20）。對于某些需要制作神經(jīng)染色和酶組織化學(xué)染色的組織固定，比一般的固定要嚴(yán)格。

3．固定液的性質(zhì)和條件

（1）能迅速滲入組織，使組織細(xì)胞形態(tài)在短期內(nèi)不至于有較大變化。

（2）固定液有相當(dāng)?shù)臐B透力，對組織各部分的滲透力相等，可使組織內(nèi)外*固定。

（3）使組織細(xì)胞不至于因固定而引起人為的改變。

（4）盡可能避免固定劑使組織膨脹或收縮。

（5）使組織達(dá)到一定硬度，獲得較佳的折光率和對染料具有較強(qiáng)的親合力。

4．固定時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)

（1）固定液及被固定的組織必須新鮮；

（2）固定液的用量一般為組織體積的10~20倍，容器不要過小，材料也不要太多；應(yīng)避免組織緊貼瓶底或瓶壁，以免影響固定液的滲入，必要的時(shí)候可以在瓶底墊上一層棉花；

（3）固定時(shí)間視組織塊的種類、性質(zhì)、大小，固定液的種類、性質(zhì)、滲透力的強(qiáng)弱，固定時(shí)的溫度的高低，實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡龋?/span>

（4）防止被固定的組織因固定劑的作用而發(fā)生變形；

（5）固定所用的固定液，以新配的為好，放置過久會(huì)失效；

（6）在固定期間搖動(dòng)組織或搖動(dòng)容器有利于固定液的滲入，對長期固定的標(biāo)本，可經(jīng)常更換固定液

（7）取材固定應(yīng)同時(shí)作好記錄，包括組織名稱、固定液和時(shí)間等內(nèi)容。

5．固定劑

單純固定劑

（1）10%甲醛：對組織滲透性強(qiáng)，固定均勻。對組織膨脹約5%，經(jīng)酒精脫水時(shí)有較大的收縮。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，長期用其固定的組織使組織變?yōu)樗嵝?，不利于染色，特別是細(xì)胞核的著色。經(jīng)自來水沖洗6~24小時(shí)后，可以使其酸堿中和，并減少結(jié)晶。

（2）4%多聚甲醛：對組織穿透性好，組織收縮小，對大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，特別是對脂肪和各種酶的固定效果更好。固定的時(shí)間不宜太長，以24小時(shí)以內(nèi)為宜，適用于免疫組織化學(xué)染色。

（3）冰醋酸：滲透力強(qiáng)，沉淀核蛋白，對染色質(zhì)固定好，使組織膨脹，故一般不單獨(dú)使用。

（4）鋨酸：價(jià)格昂貴，為強(qiáng)氧化劑，易還原成氫氧化鋨，呈黑色沉淀；必須避光保存。不能沉淀蛋白質(zhì)，而使蛋白質(zhì)凝膠化，所以對蛋白質(zhì)固定不均勻，鋨酸固定的細(xì)胞能保持生活時(shí)的形態(tài)，不收縮細(xì)胞，對胞質(zhì)固定較長好，核的固定不好，鋨酸為脂肪及類脂質(zhì)的優(yōu)良固定劑，經(jīng)它固定的脂肪和類脂質(zhì)呈黑色，特別是對于是顯示線粒體和高難度爾基復(fù)合體效果良好。

混合固定劑

（1）Carnoy液：滲透力強(qiáng)，特別適宜于固定染色體、肝糖、粘液等一些較為細(xì)微的結(jié)構(gòu)。顯示DNA、RNA效果良好。

（2）改良Bouin氏固定液：此液對一般組織固定效果都很好，固定時(shí)間為4~18小時(shí)，固定后直接放70%乙醇脫水，固定時(shí)間較長對組織亦無損害。

（七）   組織塊修整

固定后的組織塊可能會(huì)在外部形態(tài)上有些改變，或者由于組織在還未固定時(shí)就取材，組織器官較軟，取材不容易切平。經(jīng)固定后的組織有一定的硬度，此時(shí)就可以做一些修整，但改變不要太大，只是將組織材料切取平整，修掉一些不規(guī)則的部位。修整組織塊時(shí)，手術(shù)切片一定要鋒利。

四、水洗

1．目的：

洗去滲入組織中的固定液，終止固定。以免影響對組織內(nèi)結(jié)構(gòu)的觀察、分析和研究。

2．原則和方法：

固定后的組織塊的沖洗，一般情況下是置水下以自來水流水沖洗，這樣可以使組織中的固定液隨時(shí)溢出，洗得更干凈*，有些還需要進(jìn)行特殊的洗滌。

五、脫水包埋

（一）脫水

1．脫水的目的

組織內(nèi)的水不能和支持劑混合，所以必須把組織中的水分*脫除。脫水有利于組織的透明和浸蠟，有利于組織的保存。

2．脫水劑

（1）乙醇：可作固定劑，又可脫水劑，但乙醇與水混合時(shí)有較劇烈的物理反應(yīng)。高濃度的酒精對組織有強(qiáng)烈收縮及脆化的缺點(diǎn)，因此用乙醇脫水不能直接入純酒精中脫水，而必須經(jīng)過由高到低的一系列不同濃度的酒精，逐漸取代組織中水分，以保證組織脫水*，并避免組織過度收縮和硬化。

（2）丙酮：脫水能力比酒精強(qiáng)，但對組織的收縮更大，在組織學(xué)制片中較少使用，多用于病理快速切片，或用于某些組化水解酶的固定。

（3）正丁醇：是較好的脫水兼透明劑，可與酒精及石蠟混合，用于脫水是可先經(jīng)過各種不同濃度的正丁醇和乙醇混合液，再入正丁醇，進(jìn)行石蠟包埋時(shí)，可先用正丁醇和石蠟等量混合液，然后浸入純石蠟包埋，正丁醇用于脫水的優(yōu)點(diǎn)是很少引起組織收縮和脆硬，可替代二甲苯，是很好的脫水劑，但由于價(jià)格較貴，不常使用。

3．步驟

（1）乙醇脫水過程

50%乙醇      6~8小時(shí)

75%乙醇      6~8小時(shí)

85%乙醇      3~5小時(shí)

95%乙醇      1~2小時(shí)

95%乙醇      1~2小時(shí)

100%乙醇Ⅰ   1小時(shí)

100%乙醇Ⅱ   1小時(shí)

（2）丙酮脫水

如果是丙酮固定的組織，則不必再經(jīng)過乙醇，可以用新丙酮更換一次，便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的組織，均按上述乙醇脫水方法脫水，亦可由100%乙醇中移入丙酮繼續(xù)脫水2~4小時(shí)再入二甲苯透明，透明后浸蠟包埋。

（3）正丁醇脫水

組織用正丁醇脫水前，先經(jīng)50%乙醇脫水，然后移入正丁醇和乙醇混合液進(jìn)行脫水。

50%乙醇                              6~12小時(shí)

50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸餾水        5~8小時(shí)

50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸餾水        4~6小時(shí)

45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸餾水        3~5小時(shí)

25%乙醇+75%正丁醇                   2~3小時(shí)

25%乙醇+75%正丁醇                   1~2小時(shí)

15%乙醇+85%正丁醇                   1~2小時(shí)

5%乙醇+95%正丁醇                    1~2小時(shí)   

100%正丁醇Ⅰ                         1小時(shí)

100%正丁醇Ⅱ                         1小時(shí)

4．注意事項(xiàng)：

（1）脫水的過程應(yīng)逐步地而不應(yīng)驟然地進(jìn)行，不能操之過急。

（2）脫水的時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織塊的大小和組織的類型而定。

（3）組織塊在高濃度，特別是無水乙醇內(nèi)不能放置的時(shí)間太長。無水乙醇吸水能力太強(qiáng)，容易造成組織塊的過度硬化，使得切片理組織易碎裂。

（4）在脫水的過程中可以將組織塊停留在70%~80%的酒精中。

（5）每次更換新的脫水劑時(shí)（組織塊從低濃度到高濃度），都要把組織塊放在吸水紙上吸干，裝組織塊的容器也要控干水分，以免將水及低濃度脫水劑帶入高濃度脫水劑中，影響脫水效果。

（6）脫水劑的先擇要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求及實(shí)驗(yàn)室的條件

（二）透明

1．透明的目的

置換組織內(nèi)的脫水劑，為下一步的浸蠟起到橋梁作用；

使組織呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，有利于光線的透過。

2．透明劑

（1）二甲苯：是現(xiàn)在應(yīng)用廣的一種透明劑，價(jià)格較便宜，不能和水混合，遇水則變成乳白色渾濁，因此必*脫水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蠟，透明力強(qiáng)；其大的缺點(diǎn)是容易使組織收縮變硬變脆，所以組織不能在其停留過久，透明時(shí)間視組織塊的大小、性質(zhì)而定；有的組織如肌肉、肌腱、軟骨、骨、皮膚、頭皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因組織過硬不易切片；長時(shí)間接觸，對粘膜有刺激作用。

（2）苯：性質(zhì)與二甲苯相似，對組織收縮也較小，組織也不易變脆，但透明較慢，組織在其內(nèi)可以滯留12~24小時(shí)，但毒性較大。

（3）香柏油：用為透明劑，效果很好，有高度透明作用，能與醇和二甲苯混合，香柏油對組織的硬化及收縮程度比任何其他透明劑都要小，但透明的速度較慢，3mm以下厚度的組織塊需12小時(shí)以上。香柏油與石蠟不易融合，即香柏油不易被石蠟取代，因此經(jīng)香柏油透明以后，可經(jīng)過二甲苯短時(shí)間媒浸，再進(jìn)行石蠟包埋。肌肉、皮膚、血管、膀胱、垂體及腎上腺等用香柏油效果較好。

3．二甲苯的步驟：兩次透明

4．注意事項(xiàng)

（1）時(shí)間不宜過長，否則組織會(huì)變脆；

（2）組織塊脫水必*。

（三）浸蠟、包埋（石蠟包埋法）

1．浸蠟

（1）浸蠟的目的

置換組織中的透明劑，為包埋做準(zhǔn)備。

（2）浸蠟的步驟

在60度恒溫蠟箱中放置3個(gè)蠟杯，分別編號1（52℃~54℃）、2（52℃~54℃，或54℃~56℃）、3（56℃~58℃），其中分別盛軟蠟、軟蠟、硬蠟，取透明好的組織塊放入軟蠟中各1小時(shí)，迅速取出放入硬蠟，同樣放置1小時(shí)。如果時(shí)間來及包埋，可以將已經(jīng)完成浸蠟的組織塊取出放在溫箱外，第二天繼續(xù)。

（3）注意事項(xiàng)

溫箱中的溫度必須嚴(yán)格控制在60℃的范圍，不能超過60℃；浸蠟時(shí)間不宜過長。浸蠟溫度過高或時(shí)間過長使組織收縮過度收縮和脆變。

2．包埋

（1）步驟

①準(zhǔn)備包埋蠟：一般應(yīng)用硬蠟（56~58℃或60~62℃）為好，所用的石蠟要求透明無雜質(zhì)，新的石蠟要反復(fù)熔凝，并有一定的粘韌性，可以加一些蜂蠟。蠟的熔點(diǎn)應(yīng)與組織的硬度相適應(yīng)。包埋用過的石蠟可以反復(fù)使用。

②準(zhǔn)備包埋框：可以用金屬的，也可以用硬紙摺疊。

③點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好無齒尖鑷子，需作標(biāo)記應(yīng)先寫好標(biāo)簽。

④在金屬框中倒入硬蠟，然后用無齒鑷子取組織塊放入石蠟中，置好方向?？墒覝叵吕鋮s。

⑤包埋框或紙盒內(nèi)的蠟逐漸凝結(jié)，若表面已凝結(jié)形成一層固體狀，即可放入冷水中，加速其凝固。

⑥待蠟塊*凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆開紙盒，取出蠟塊。

（2）注意事項(xiàng)

①包埋時(shí)夾取組織的鑷子，用酒精燈隨時(shí)燒熱，以免石蠟?zāi)Y(jié)后粘附在鑷子上，造成蠟塊凝固不均勻。

②包埋操作要迅速，組織從浸蠟杯中取出置入包埋框中的時(shí)間應(yīng)盡量縮短。

③包埋后的蠟塊應(yīng)呈均質(zhì)半透明狀，如果出現(xiàn)白色混濁狀，一般出現(xiàn)在組織周圍或組織的底部，應(yīng)考慮這樣幾個(gè)方面的問題：a. 脫水不*。b.包埋蠟溫度低了，組織進(jìn)行包埋時(shí)，包埋框中的蠟已成凝結(jié)狀。c.組織內(nèi)還殘留有較多的透明劑，d.石蠟不純。

④包埋箱中的溫度必須保持恒定。

⑤如包埋得不好，可將蠟塊溶化，重新浸蠟和包埋。

⑥較小的組織可在脫水透明時(shí)開始用伊紅染色

六、石蠟切片制備

（一）石蠟切片前的準(zhǔn)備

1．切片刀。傳統(tǒng)的切片刀在使用之前，一定要在顯微鏡下檢查刀口的損傷程度，然后進(jìn)行磨刀。現(xiàn)在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。

2．修整蠟塊：切去組織周圍過多的石蠟，一般情況下在組織周圍留有約1~2mm的石蠟邊，兩邊必須平行。

3．蠟塊固定：修整好的蠟塊先固定在事先準(zhǔn)備好的小方木塊或者金屬塊上，固定方法是把蠟鏟先在酒精燈上加熱，再將蠟塊底部烙熔，迅速烙粘在小方木塊或金屬塊底座上。

4．載玻片擦洗干凈后，在其表面涂上粘附劑（蛋白甘油、APES或多聚賴氨酸），根據(jù)染色方法選擇不同的粘附劑。

5．準(zhǔn)備好毛筆、鑷子、染色架。

6．調(diào)好展片器內(nèi)水的溫度（45℃），有時(shí)也可以加些酒精到水中。

（二）石蠟切片

1．將切片刀裝在刀片機(jī)的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。

2．切片多使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，切片時(shí)，左手執(zhí)毛筆，右手轉(zhuǎn)切片機(jī)轉(zhuǎn)輪，先修出組織塊。

3．調(diào)整切片機(jī)上的切片厚度為4~7µm，然后切片。

4．切片可以是單張，也可以是連續(xù)切片形成蠟帶

5．展片和撈片：

（1）直接展片法：在載玻片上滴加幾滴蒸餾水，然后把切片鋪在小滴上面，用酒精燈在載玻片下面加熱，待*展平，傾斜載玻片，倒棄多余水分，同時(shí)擺正切片。

（2）溫水漂浮法：此法用展片機(jī)或者用恒溫水浴箱，先使水溫保持在45~50℃，用左手拿毛筆輕輕托起切片，用右手用眼科鑷子夾起切片的一角，正面向上輕輕平鋪放置于展片器的水面上，動(dòng)作要輕快，切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會(huì)自然平整地展開，必要時(shí)可用眼科鑷輕輕拔開，然后撈片，并及時(shí)編號。

6．展好的切片在室溫下稍微干燥后，放在40℃恒溫烤箱中，小片組織30分鐘即可，大的需12~24小時(shí)，烤干備用。

（三）注意事項(xiàng)

1．切片刀刃傾斜過大或過小都不能正常進(jìn)行切片。

2．修整蠟塊時(shí)要細(xì)心，看清楚組織在蠟塊中的位置，以免將需要的組織修掉。

3．連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)的轉(zhuǎn)輪時(shí)，速度一定要均勻，不能時(shí)快時(shí)慢，以免切片厚薄不一。

4．使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片時(shí)，是由下向上切，為得到定然整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬、脆難切的部分放在上端，如皮膚應(yīng)將表皮部分向上，腸胃等組織應(yīng)將漿膜面面朝上。

5．用展片器展片時(shí)，水溫應(yīng)根據(jù)使用的石蠟熔點(diǎn)進(jìn)行了調(diào)整，一般低于石蠟熔點(diǎn)10~15℃；撈片的時(shí)候動(dòng)作要輕、稍快。動(dòng)作太大容易出現(xiàn)氣泡。如果沒有展片器可以用溫水浴鍋來代替。

6．單個(gè)切片要擺到載玻片的1/3與2/3交界處；連續(xù)切片的粘片順序一般是從左到右，組織切片較小是，可以并列粘貼2~3條蠟帶。

7．烤片的溫度不宜過高；烤片的時(shí)間要合適。腦組織要待稍微晾干一些后，才能烤片，否則容易產(chǎn)生氣泡影響染色和觀察。

七、H-E染色

（一）步驟

1．脫蠟

二甲苯I             10分鐘

二甲苯II             5分鐘

2．水化

100%酒精I(xiàn)            5分鐘

100%酒精I(xiàn)I           5分鐘

95%酒精I(xiàn)             5分鐘

95%酒精I(xiàn)I            5分鐘

85%酒精              3分鐘

75%酒精              2分鐘

蒸餾水沖洗           1分鐘

3．染色

蘇木精染色           5分鐘

自來水洗

鹽酸酒精分化         15秒

自來水洗（鏡檢）

自來水洗             15分鐘

蒸餾水洗              2分鐘

75%酒精              2分鐘

85%酒精              2分鐘

0.5%伊紅染色         1分鐘

95%酒精I(xiàn)             5分鐘

95%酒精I(xiàn)I            5分鐘

100%酒精I(xiàn)            5分鐘

100%酒精I(xiàn)I           5分鐘

二甲苯I               5分鐘

二甲苯II              5分鐘

4．封片

中性樹膠封片

上述處理好的玻片，取中性樹膠滴入載玻片的組織上，取蓋玻片從一端逐步蓋下去，避免發(fā)生氣泡

（二）注意事項(xiàng)

1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的處理是不一樣的。

2．染色過程中所用的時(shí)間要根據(jù)染色時(shí)的室內(nèi)溫度、染液的新鮮程度及實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況等靈活掌握。在室溫高、切片、染色液又是新配制的，染色時(shí)間就要短，反之時(shí)間就長。

3．伊紅有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，應(yīng)該在脫水前進(jìn)行染色，如果是醇溶的，應(yīng)使用與溶解伊紅等濃度的酒精開始脫水。

4．在二甲苯脫蠟之前可以先在60℃烤箱內(nèi)0.5~1小時(shí)，這樣可以使切片粘附更牢固不易脫片，也有利于脫蠟。

5．二甲苯在HE染色中有脫蠟、透明的作用。二甲苯脫蠟的好壞主要取決于切片在二甲苯內(nèi)放置的時(shí)間和脫蠟時(shí)的溫度以及二甲苯的使用次數(shù)。染好的切片必須經(jīng)過透明，有利于顯微鏡觀察，同時(shí)并為封片起到了橋梁作用。

6．用梯度酒精脫水時(shí)，在低濃度酒精中時(shí)間不宜過長，到高濃度時(shí)逐步延長脫水時(shí)間。以免脫水不*，影響二甲苯透明的效果。

7．在酸性分化液內(nèi)停留的時(shí)間不要過長，分化不可過度，避免使細(xì)胞核內(nèi)該染上色的結(jié)構(gòu)脫色。不需分化處理的蘇木精染色時(shí)要注意掌握染色時(shí)間，以防止組織切片染色背景過深或細(xì)胞核、胞質(zhì)染色不足。